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来自前辈的经验】液相色谱仪小概率故障如何排除?

发布者: 实验室 | 发布时间: 2021-5-1 18:39| 查看数: 31| 评论数: 0|帖子模式

液相色谱对于多数人来说都是很好上手的仪器了,但是就算是用过几年、经验丰富的分析员都会习惯于一些错误的操作(师傅教错了?),经常导致一些仪器故障。方便快捷的分析过程固然重要,但是为了多做样品而忽略了一些必不可少的步骤,往往得不偿失,哪些操作不能做?哪些懒儿不能偷?那些小概率的故障师傅没教怎么办?液相使用过程中有哪四大关键因素要注意?本文一一告诉你哦!

流动相不过滤


因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀,因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内蒸馏,而常用的方法是滤过,可采用Millipore滤膜(0.2μm或0.45μm)等滤器。泵的入口都应连接砂滤棒(或片)。输液泵的滤器应经常清洗或更换。


使用后没有及时清洗泵

流动相不应含有任何腐蚀性物质,含有缓冲液的流动相不应保留在泵内,尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内,由于蒸发或泄漏,甚至只是由于溶液的静置,就可能析出盐的微细晶体,这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。因此,必须泵入纯水将泵充分清洗后,再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂(对于反相键合硅胶固定相,可以是甲醇或甲醇-水)。


流动相走空

泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完,否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环,最终产生漏液。

没有流动相流出,又无压力指示怎么办?
可能是泵内有大量气体,这时可打开泄压阀,使泵在较大流量(如5ml/min)下运转,将气泡排尽,也可用一个50ml针筒在泵出口处帮助抽出气体。另一个可能原因是密封环磨损,需更换。


压力和流量不稳了?

原因可能是气泡,需要排除;或者是单向阀内有异物,可卸下单向阀,浸入丙酮内超声清洗。有时可能是砂滤棒内有气泡,或被盐的微细晶粒或滋生的微生物部分堵塞,这时,可卸下砂滤棒浸入流动相内超声除气泡,或将砂滤棒浸入稀酸(如4mol/L硝酸)内迅速除去微生物,或将盐溶解,再立即清洗。


压力为啥过高或过低?


可能是是管路被堵塞,需要清除和清洗。压力降低的原因则可能是管路有泄漏。检查堵塞或泄漏时应逐段进行。

在进行梯度洗脱时,由于多种溶剂混合,而且组成不断变化,因此带来一些特殊问题,必须充分重视:

PS:(在液相色谱中对组分复杂的样品采用梯度洗脱的方法。在同一个分析周期中,按一定程序不断改变流动相的浓度配比,称为梯度洗脱。从而可以使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。

梯度洗脱的优点:1.缩短分析周期;2.提高分离能力;3.峰型得到改善,很少拖尾;4.增加灵敏度。但有时引起基线漂移。)


梯度洗脱的流动相选择不当

要注意溶剂的互溶性,不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在一定比例内混溶,超出范围后就不互溶,使用时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液混合时,还可能析出盐的晶体,尤其使用磷酸盐时需特别小心。


忽略的空白梯度洗脱

梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高,以保证良好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱,以辨认溶剂杂质峰,因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气,以防止混合时产生气泡。


忽略了溶剂混合所带来的粘度变化

混合溶剂的粘度常随组成而变化,因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。例如甲醇和水粘度都较小,当二者以相近比例混合时粘度增大很多,此时的柱压大约是甲醇或水为流动相时的两倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。


关于六通阀的正确使用和维护

①样品溶液进样前必须用0.45μm滤膜过滤,以减少微粒对进样阀的磨损。

②转动阀芯时不能太慢,更不能停留在中间位置,否则流动相受阻,使泵内压力剧增,甚至超过泵的最大压力;再转到进样位时,过高的压力将使柱头损坏。

③为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中,每次分析结束后应冲洗进样阀。通常可用水冲洗,或先用能溶解样品的溶剂冲洗,再用水冲洗。


关于色谱柱的使用和维护

色谱柱的正确使用和维护十分重要,稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中,需要注意下列问题,以维护色谱柱。

调节流速太快。。。
避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况;柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料,因此在调节流速时应该缓慢进行,在阀进样时阀的转动不能过缓(如前所述)。

反冲色谱柱。。。
一般说来色谱柱不能反冲,只有生产者指明该柱可以反冲时,才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。

预柱和保护柱。。。
选择使用适宜的流动相(尤其是pH),以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱,分析柱是键合硅胶时,预柱为硅胶,可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”,避免分析柱中的硅胶基质被溶解。

避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内,需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。


【来自前辈的经验】小概率故障如何排除?

【1】泵压跳动,跳动范围10bar左右。。。

解决方法:
1、原先小白头有点脏,更换后尚未解决;
2、将主动阀上的阀芯取出后,发现有类似气泡存在,浸入甲醇-水溶液超声5min,以试着去除气泡,重新将其安装后再观察,仍未解决;
3、更换新的阀芯,将其安装后,不再有跳动,观察一段时间后比较平稳,成功解决。

【2】发生故障:
①plug homing over pressure
② 灌注及设流速时均无压力也不见液体流出
③检测器光闸不能复位④进完大浓度样品后,进空白相应位置也出峰。。。

可能原因:
①在线过滤器堵了
②泵头下单向阀堵了
③有可能是检测池脏了,也有可能是光路有点堵,再不行可能是灯寿命到了
④小抹布脏了,需要换

解决方法:
①在线过滤器卸下来,置烧杯,加纯化水煮沸5-10分钟后甲醇超一下一般就可以了,如果还堵的话就拿稀硝酸泡,还不行的话就换新的了,这本身是个消耗品

②把泵头下单向阀卸下来,两个都有可能堵,刚卸下来时竖着在耳边摇一摇是听不到声音的。简单的拿洗耳球把单向阀吹吹就行了(注意方向),吹了没反应可以拿溶剂超声,但不可水煮,一般超至在耳边摇能听见声音就不影响实验

③先用溶剂把检测池冲冲,用啥试具体样品而定;若冲了还不行,把检测池卸下,看灯能量,若能量还可以(有个几千),可能得清洗光路了。第一次清洗的话建议还是叫工程师来,因为待清理的部件在检测器的最下方,有一个黑色片片,中间有一条缝,而且那一块的螺丝都是八角的,卸起来很麻烦。

④把5个样品盘都拿出来,可以看见里面有一个黑色突起(看不清用手电筒),平时进样针就是从那个地方吸样的。手伸进去就可以卸下来,里面有一个小白圈圈(用多了自然就黑了),换一个新的就行了,买仪器时一般配有10个。


液相色谱在使用过程中的四大关键因素


1.液相色谱仪本身:
对于仪器本身一般不会有问题,特别是刚买回来的新仪器。对于仪器本身最重要的就是仪器的校验,刚买回来的仪器一般都是由卖家先对仪器做系统的确认工作(包括IQ、PQ、OQ),确认顺利通过后,再请国家或省级仪器检定局的来校验,检定合格后就可以放心使用了,除此之外,一些做得好的公司每半年会对仪器进行一次的内部校验,目的就是为了保证仪器的正常可运行状态。

2.色谱条件:
色谱条件一般包括流动相、色谱柱、检测波长、流速及进样量。流动相就涉及到配制流动相所用到的水和试剂试液,水一般要求用超纯水或其他水的电阻率不大于18.2兆欧级别,试剂试液要求用色谱级别的,原因为防止水和试剂试液中的杂质对色谱结果的干扰。色谱柱会因不同的品种而有不同的要求,但每根色谱柱都有它的清洗要求,这个在色谱柱说明书上都可以找到,一定要根据上面的要求进行,否则会造成色谱柱效下降和色谱柱的使用寿命缩短,检测波长也会因品种的不同有不同的要求,这里需要指出的是要注意观察检测器氘灯能量的变化,比如基线波动大,活性成分的响应值突然变小等,都有可能是氘灯的能量不足所引起的,氘灯一般建议使用800小时,但实际上使用时间不止,可根据实际情况更换。流速也因品种的不同而不同,一般为1.0ml/min,流速是不可随意改动的,特别是作为QC人员,但是作为研发人员,有时为了摸索条件或进行方法耐用性验证,会对流速进行改变以评价方法的适用性。对于进样量因不同的品种也有不同规定,进样量这块现在都使用自动进样,所以进样精密度都很好,不需强调什么。

3.操作人员:
首先,作为液相操作人员,一定要认真学习夜想的说明书,掌握液相硬件和软件的操作,掌握日常的维护保养,掌握最基础故障的排除和维修。一般液相的操作规程也是有操作人员起草的,所以只要严格按照操作要求进行操作,一般不会出现问题,当然啫喱需要特别指出的是对于液相的日常维护保养很重要,比如流动相的过滤、脱气、泵密封垫的清洗、系统管路的清洗、溶剂过滤头的清洗等,倘若不坚持,很容易导致色谱柱堵塞、系统压力过大、色谱峰异常等不必要的故障,浪费时间。其次,操作人员在配制液相分析用样品溶液时,最好由同一个人单独完成,以免不必要的偶然误差。

4.液相安装环境:
液相色谱仪应尽量安装于水平、远离振动、电磁干扰的屋内的台面上,有条件的话尽量将液相数据处理系统分隔开,一个是防止色谱基线噪音偏大,基线不稳等,一个是为减少对人体的危害。


液相色谱仪的保养知识


一、仪器的保养

1、整机保养
(1)短期停机
在完成一天工作以后,都要停机等第二天再继续工作,则可按以下步骤停机。

A)关闭二次仪表(记录仪、积分仪或色谱工作站)。
B)关闭检测器电源(同时切断柱箱温度检测器的电源)。
C)停止恒流泵工作,然后切断其电源。
D)用二次蒸馏水冲洗进样阀的进样孔(在“LOAD” 和“INJECT”两个位置)。
E)切断实验室工作电源,加满盛液瓶中的流动相,待第二天使用。
F)将仪器罩上防尘罩。

(2)长期停机
仪器须数周或数月暂不使用,这时除按《短期停机》的A)~ D)步骤处理外,还须完成以下步骤:

A)拆下恒流泵的流动相盛液瓶,换上色谱柱指定的保护试剂(例:甲醇、去离子水等),开启泵数分钟 (流速0.5 mL/min ~ 1.5 mL/min)后停泵。
B)从系统中拆下色谱柱,用专用的密封螺帽将柱管两端密封后保存。
C)用普通φ1.6导管替代分离柱联结。
D)用二次蒸馏水或去离子水输入输液泵,开启泵,流量1mL/min~2mL/min, 冲洗泵体、进样阀、检测器流通池数分钟,在冲洗过程切换六通阀数次,使定量管得到清洗。
E)拆除替代柱的导管、泵输入端和出口的导管和流通池输入、输出口导管, 分别用螺帽密封输液泵出口和流通池输入、输出口。
F)拨下总电源接线板的插头,贮存好专用的流动相和样品,用干布擦洗仪器,罩上防尘罩。
G)检测器存放地点应干燥。

2、输液泵的保养
输液泵是液相色谱仪的心脏部件,品质再好的泵,若不注意日常保养,其损坏的几率是极高的,将大大降低仪器的使用价值。

a)使用甲醇作流动相,请注意自身保护和环境保护,废液注入空瓶内,集中处理,不得倒入下水道内。
b)输液泵使用前,先注意探漏检查,视各 密封点和泵体有否漏液。
c)在无流动相通入的情况下,严禁启动泵体电机,以免柱塞密封环磨损。
d) 测试泵流量性能时,用于收集液体的容器, 应选用小口瓶颈的容器,防止收集过程中,溶液蒸发,影响测量精度。必要时应将其密封存放在干燥容器内,以预防光学系统霉变。
e)金属泵体的输液泵,应尽量避免使用含有卤离子(如KCL、NaCL、NH4CL)的流动相或能产生卤离子的流动相,若必须使用此类流动相,建议使用泵体用非金属材料制造的输液泵。方则使用后,应立即使用去离子水清洗泵体和整个色谱系统的管路。
f)使用的流动相必须是HPLC级或分析纯级,特别是配置的流动相,在使用前,必须过滤掉其中的颗粒状杂质和其他物质(使用0.45μm的滤膜过滤)
g) 长期不使用输液泵,应在最后分析结束时,用注射器吸取去离子水通过专用的泵头清洗孔清洗泵体和柱塞杆。以延长密封圈和宝石柱塞杆的寿命。
h) 输液泵液路在维修或保养时,应切断仪器电源。非专业维修人员请不要打开机箱罩。

3、清洗单向阀和阀体
可以按下图来清洗(仅供参考):

——非专业仪器维修人员不得装拆输液泵的泵体和单向阀。
——各种不同型号的输液泵机械结构有所不同,维修人员清洗或更换柱塞棒和密封环时,须严格按照该仪器厂商提供的资料(维修说明书)的程序进行。
清洗单向阀可以参考下图:
单向阀不易损坏,但长期运行,会有污染物粘在阀芯中的宝石球和宝石座上,为此须拆开阀体,进行清洗。


4、六通阀的保养
六通进样阀是确保分析精度的重要部件,在高压液体的压力下阀面旋转60度,并确保不漏液,这就要求输液孔的密封面上不能有一点微小的固体杂质。因此进入六通阀的样品必须进行过滤处理,以保证分析样品中呈完全的液体状态。

样品的处理方法和需用器具如以下所示:
过滤样品的器具为:

测试样品的处理:

专用注射器:
若进样量小于20微升,可使用50微升的微量平头注射器(液相专用)。

每次进样保持20微升,可使用1毫升的注射器,但必须使用特殊的平头注射针头,每次注射量约0.05~0.1毫升,可一次吸取0.9~1毫升的分析样品,多次进样。(转动进样阀时,不必拔出注射器)


5、六通阀的清洗
当多次进样,特别是注射过高浓样品或黏度较大的样品后,很容易污染阀体。因此当使用久后,必须进行清洗。
可采用阀体专用的清洗接头(下图),按图所示接在2ml~5ml的注射器上,吸取酒精溶液,然后从进样口注射进去,余液从排液管导出,在“LOAD”和“INJECT”两个位置各进行数次。

最后再用二次蒸馏水冲洗数次用干净的压缩空气或氮气吹净进样口及定量管、废液管中的余液,待用。

当六通阀污染严重或通孔有异物进入而堵塞时,则必须将阀拆开,取出其中定子、定子组件、转子密封圈,浸入酒精溶液中清洗,然后再用超声波清洗器在二次蒸馏水浸洗中进行清洗,用干净气体冲洗各通孔后,烘干,重新组合装配。

6、液相色谱柱的保养
重新安装时,可稍稍削去柱管输入端管口一薄层固定相(最好削后用同类固定相填补)然后装上过滤片,拧紧柱接头,封闭两端螺口。


色谱柱常期不使用时,除了进行清洗处理外,还必须在其中充入该柱规定的贮藏液(甲醇、去离子水等)后再密封保存,重新启用时,应用流动相冲洗数分钟后,再接入检测器,以免贮藏液进入流通池。
注:液相色谱柱的种类繁多,不同的分析对象,应选用不同的分离柱、流动相和操作波长。在实际应用中用户可参阅专业液相色谱仪文献和书籍中介绍的内容结合本仪器的特点,选择最佳的分析条件,以达到您的分析目的。

7、液相检测器的保养
微小的颗粒杂质或薄膜沉积在流通池里,会导致基线噪声的增加或降低灵敏度。此时必须进行清洗处理。一般常规清洗不必拆下流通池,可直接在流通池入口处(即检测器输入端),接上一个专用的注射器接头,依次用去离子水、酒精和3M HNO3冲洗流通池,最后用去离子水反复冲洗数次。检测器出口用玻璃瓶盛接流出的废液。
若检测器已长期使用或受到高浓度样品的污染,经上述方法还不能除去污垢,就得取下流通池,按以下步骤拆开进行清洗:

1)卸下紫外检测器侧面遮盖流通池的盖板,松开固定流通池支架的螺钉,小心地取出流通池支架。
2) 拆下连接流通池输入、输出端的不锈钢导管(或PEEK导管),卸下流通池体。仔细拧下石英窗和透镜的护圈。小心取下垫圈、石英窗、透镜、护圈,放在一个盛有乙醇的烧杯内,用超声波清洗机处理5min~10min。
3) 用蒸馏水、乙醇冲洗流通池,并用超声波清洗,最后用去离子水冲洗数次,除去池内杂物。
4)烘干各部件(注意:避免用手直接接触透镜及石英窗)。
5)重新装配流通池体。
6) 按原样装在流通池支架上,并接好导管,并进行试漏。(方法:池体输入端与恒流泵连接,开启恒流泵(流动相用蒸馏水),视各密封点及石英窗口是否有漏液溢出。
7)装入紫外检测器机箱内,盖上盖板,并用原螺钉、螺帽固定。

注:上述拆洗应有经培训过的专业维修人员进行。

8、使用液相色谱仪应注意的事项

(1)开启输液泵后,应放空泵的输出端,排除泵体内的气泡再与进样阀、色谱柱相接,方能使流速稳定。
(2)第一次使用的色谱柱或进样过高浓度样品的色谱柱,应在设置流量下,将柱出口放空,老化数小时后,再与检测器的流通池输入端相连接。
(3)开启柱箱温度控制器后,应注意色谱柱的最高使用温度,防止过温。
(4)检测器开启后,请勿带电搬动位置,防止机内氘灯损坏。
(5)流通池流出的废液必须集中收集处理,防止污染环境。
(6)必须使用平头专用注射针进入样品,严禁使用普通针尖针头进样。若进样量小于定量管的容量时,可使用微量平口注射器注入六通阀后(不要拔出注射器),立即转动六通阀,完成一次进样。
(7)当信号电压超过1V或满量程信号超过量程范围时,有可能出现“平头峰”,其积分面积及保留时间会产生很大的误差,此时应稀释样品或扩大量 程范围后再 进样。


二、液相色谱仪常见故障排除

液相色谱仪结构复杂,且不同型号的色谱仪,出故障时产生的现象有可能不同,以下罗列的现象仅供参考:

1、现象:输液泵压力指示为零(或<0.5 MPa)且柱后无液体流出。
原因:(1)柱前导管接头漏液;(2)泵柱室内有大量气泡存在;(3)贮液瓶内试剂用完;(4)输液泵未工作。
对应 排除方法:(1)检查各接口是否有漏液;(2)放开泵出口接头;用“清洗”键冲洗泵体;(3)添加流动相;(4)按输液泵操作方法,检查其工作状态。

2、现象:输液泵压力指示超过规定的范围,且柱后无液体流出
原因:(1)分离柱阻力过大(陈旧柱子);(2)柱前导管堵塞;(3)泵柱塞内有少量气泡存在;(4)柱子进口处过滤膜堵塞;(5)进样阀手柄未旋到底(处于中间状态);(6)导管中有颗粒状固体堵塞
对应排除方法:(1)更换柱子;(2)从柱后开始逐级向上拆开接头检查;(3)拆开泵接头,用“清洗”档赶尽气泡。;(4)拆开柱前接头、更换或清洗过滤膜;(5)左右旋动六通阀至极限位置;(6)逐级检查,并更换导管。

3、现象:柱前压力逐渐升高
原因:(1)流动相中存在大颗粒的物质;(2)样品未经过过滤处理;(3)柱子输入端滤片污染
对应排除方法:(1)流动相经<5μ的真空抽滤瓶过滤后再使用;(2)样品须经滤膜过滤;(3)拆下柱的滤片用超声波清洗,同时刮去柱口表面被污染的固定相

4、现象:基线大幅度波动(即紫外检测器的输出电平值极不稳定)
原因:流通池内留有大量的气泡;流通池漏液;紫外检测器有故障
对应排除方法:排除气泡;检修流通池;停止恒流泵工作,检查紫外检测器

5、现象:组分峰极小或不出峰
原因:(1)波长选择不正确;(2)检测器输出衰减 太大;(3)进样口漏液;(4)进样阀样品废液管堵塞,样品未进入定量管;(5)进样后未按启动键;(6)定量管容积过小;(7)样品浓度过稀;(8)检测器灯源老化或失效;(9)流动相不纯
对应排除方法:(1)按标准重新选择波长;(2)重新选择输出量程范围;(3)修理进样阀;(4)拆下六通阀上废液管(5#,6#)重新安装;(5)进样后立即按启动键;(6)更换大容量定量管;(7)浓缩样品后再进样;(8)更换灯源;(9)选择高纯度的流动相

6、现象:温度指示波动>±1℃
原因:(1)设置温度值过低;(2)柱箱密封盖未盖好;(3)温度控制器未启动;(4)柱箱升过高温后,再设置低温;(5)温控部件有故障;(6)控温铂电阻接触不良
对应排除方法:(1)设置最低温度应室温以上10℃;(2)检查柱安装过程;(3)按 起始 键(指示灯亮);(4)开机后会逐渐稳定(正常现象);(5)修理温度控制器;(6)拧紧固定铂电阻引 线的螺钉

7、现象:检测器开机时屏幕 显示不正常,出现缺字、坐标图形异样、光标无法移动等象。
原因:工作电源不正常或仪器附件有强干扰源存在
排除方法:检查工作电源电压,采取稳压措施;关机后重新开机;检测器微机系统故障。

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